斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是动机细菌传染的要紧招致经过。,细菌和主人有毒的传染。在这项收场白中,我们的开展了斑马鱼胚胎肺炎双孢子球虫脑膜炎典范,为了实时值班主人初期的缩微片相互作用。。

方式:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室细的喷流绿色荧光性逃离型肺炎链双孢子球虫D39或肺炎链双孢子球虫破裂。kdrl:mCherry的生殖细胞的细胞质转移斑马鱼线飞船形象, 抗L – PLASTIN色彩后可值班到吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光性中性粒细胞和白色荧光性巨噬细胞。荧光性共焦显微镜和推延显微镜成像。。

发生:尾动脉传染后,我们的可以警告肺炎双孢子球虫过剩在有焦点的飞船。,细菌经过血脑B进入蛛网膜的下腔和脑薄纸。与逃离型肺炎链双孢子球虫比得上,脑室内离解的肺炎链双孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示早期在蛛网膜的下腔对肺炎链双孢子球虫的特有的豁免反馈噪音首要由嗜中性粒细胞联合集团,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤有活性的,吞噬细胞显著的扩张。。

收场白:这种新的脑膜炎典范容许实时辨析和形象肺炎双孢子球虫脑膜炎的主人-缩微片相互作用。这是额外的认得PN发作机制的独一很许诺的器。。

关键词:肺炎双孢子球虫脑膜炎  肺炎链双孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链双孢子球虫  斑马鱼  主人-缩微片相互作用

放:Streptococcus pneumoniae是死亡传染的首要招致。,如脓毒疾、肺炎和脑膜炎。依然肺炎双孢子球虫疫苗和无效的抗菌被加工处理已作出,但迎合性肺炎双孢子球虫病的呕吐担负依然很高。,最最资源薄的的国家的。。肺炎双孢子球虫脑膜炎是小孩和ADU的一种死亡细菌的脑膜炎。。肺炎双孢子球虫性脑膜炎的易敏感性和死亡职别由HOS决定。大脑的当然屏蔽的豁免国务的和遇难船的残骸。晚近,寄主的遗传联合集团越来越受到人性的关怀。,譬如,特有的豁免接受器(Toll样接受器4)、Fcγ(Fcγ)接受器和杀菌素体系的遗传离解,决定其易敏感性。,最要紧的是直链淀粉压缩。,有超越90种形形色色的树液型。。形形色色的树液型的运送率和迎合性形形色色的。。等等要紧毒力生殖细胞的细胞质,它包含细胞有毒的溶血素和几种细胞在表面工作蛋清。,譬如,Streptococcus pneumoniae在表面工作蛋清A(PSPA)。细菌和主人暗打中相干驱车旅行肺炎的染色体组离解。生殖细胞的细胞质区的在与脱漏,也去核染色体组打中单核糖酸离解都能扩张病菌动机呕吐和发生影响呕吐死亡职别的资格。为了收场白肺炎双孢子球虫的毒力,发觉了形形色色的的实验mouse的复数形式典范。。这些mouse的复数形式典范的限度局限包含伦理观成绩。、实验所需的高成本和高时期;这些限度局限使得mouse的复数形式志趣不相投的大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)仓促变成独一收场白的人类病菌或其互相牵连肉体的病菌动机的传染性呕吐的要紧浇铸生物。斑马鱼是一种特有的和机动性豁免体系类似地人体豁免体系的多骨鱼。特有的豁免体系在斑马鱼胚胎发生的初期阶段仓促快的,受精后的机动性豁免体系为4。 – 6周训练。该典范的另独一优点是鉴于斑马鱼胚胎的玻璃状态和广泛应用的荧光性器,它可以实时收场白主人与病菌暗打中相互作用。。等等的优点包含斑马鱼的高繁殖力、胚胎外面的发生与生殖细胞的细胞质编辑程序器和G的适用性。以及,该典范用于加强语气于中容量预备。,经过毒力变奏或血管中层预备评议细菌破裂。。最近的,该典范已被应用于形象和收场白结核分支杆菌脑膜炎–一种中枢神经体系传染病。以及,仓促显示出斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎双孢子球虫传染并发生脑膜炎。收场白决意是发觉一种容许肺炎双孢子球虫病菌相互作用的实时辨析的斑马鱼胚胎传染肺炎双孢子球虫脑膜炎典范。传染的形象是生殖细胞的细胞质转移鱼(KDRL)的应用。:MCherry)白色荧光性飞船。,荧光性远红外色彩联合集团荧光性打手势抗。双打手势MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更片刻地举行了收场白斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光性中性粒细胞和白色荧光性巨噬细胞。

方式:细菌菌株与扩展先决条件:肺炎链双孢子球虫2型逃离菌株D39和溶血素脱漏M 肺炎双孢子球虫菌株扩展在含5%脱似丝的羊血的哥伦比亚特区洋菜平直地,培育先决条件37℃,5%的CO2。肺炎双孢子球虫菌株泄漏物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于外面的和体内成像。。氯胺苯醇g/kg血管中层转变菌的预备。细菌借宿培育后,托德挂中添加酵母抽取的的收场白 休伊特液,在37摄氏温度到对数中央扩展。。细菌搜集,以离心机分离(6000转/分),10分钟),无菌的汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,挂于含20%醋精的PBS以通行所需浓度和储在?80°C。细的喷流前,细菌挂于无菌的(W/V)酚红喝酒中。,细的喷流工艺流程形象。

斑马鱼给食的、胚胎管理与细的喷流举动:(kdrl:mCherry逃离型斑马鱼飞船内皮细胞表达白色荧光性;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度扩展,通氧,10/14h的光暗圈出境况。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚木精蓝E3血管中层打中PTU培育,限定黑素细胞排队。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独自细的喷流1 NL肺炎链双孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的遗物实验:传染病毒后,破裂的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板打中培育,每组一孔,每孔20个胚胎。细的喷流后12小时和120小时决定死亡率。,在常客时期点检查活胚胎和死胚胎。,占有实验均在3个一致实验中举行。。

斑马鱼胚胎的荧光性成像:HLPA荧光性显微镜 GFP肺炎链双孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎举行镜头学预备。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光性细菌的胚胎在仓促决定的时期点被固定。4%仲甲醛常客借宿。。随后,胚胎在100%℃伯醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的时期生长荧光性成像:一分钟内图像陆续搜集。胚胎嵌在低熔点洋菜糖中使溶解为液体于人工。,认为在28度。。

豁免薄纸化学色彩:anti-l-plastin色彩斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗透,10%法线山羊树液(NGS)打中1%种 PBTX关门3h,安装异性对称体联合集团的扩张。anti-l-plastin(1:500 v/v冲淡的)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛树液白蛋清(BSA)室温下孵育借宿。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育借宿。。

薄纸病理辨析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%仲甲醛常客,白腊包埋部件,4微米厚。Nissl色彩,并值班色彩部件。。

发生:后脑脑室和尾动脉细的喷流肺炎链双孢子球虫动机斑马鱼胚胎爆发性、一次依赖性传染:脑室后传染:根究肺炎链双孢子球虫可动机斑马鱼胚胎的脑膜炎,我们的率直的将细菌细的喷流到腹侧脑室。,传染是一次依赖性的。,高一次的细菌动机早发,死亡率高。100CFU细的喷流液的存活比为88%。,300 CFU细的喷流存活比为25%。,600 CFU细的喷流存活比为5%。。

通身性传染:肺炎双孢子球虫细的喷流液在高一次下的一次依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎平均数的遗物率为0。。与侧脑室细的喷流比得上,尾动脉细的喷流可招致呕吐开展较快。。在全部斑马鱼体内和中枢神经体系都值班到细菌湿透。薄纸学辨析泄漏,远在12的细菌 脑软组织内呈现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎双孢子球虫性脑膜炎早期的特有的豁免反馈噪音首要由中性粒细胞联合集团。

收场白:仓促开展出了一种新的形象斑马鱼胚胎传染典范。该典范有助于我们的对细菌的毒力生殖细胞的细胞质和主人重获机制在肺炎双孢子球虫脑膜炎发作机制中相互作用的变得流行。以及,我们的值班到计划Streptococcus pneumon的对象率直的细菌毒性。,肺炎双孢子球虫脑膜炎的避免、主人介导的有毒的介导的脑内。

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