斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是惹起细菌传染的要紧解释经过。,细菌和主办宴会毒死传染。在这项认为如何中,本人排队了斑马鱼胚胎肺炎双孢子球虫脑膜炎塑造,为了实时注意主办宴会前段的起源相互作用。。

办法:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室开枪绿色荧光性野生的型肺炎链双孢子球虫D39或肺炎链双孢子球虫演变所引起的。kdrl:mCherry的遗传因子转移斑马鱼线网形象, 抗L – PLASTIN颜料后可注意到吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光性中性粒细胞和白色荧光性巨噬细胞。荧光性共焦显微镜和推延显微镜成像。。

胜利:尾动脉传染后,本人可以记录肺炎双孢子球虫堵车在病灶的网。,细菌经过血脑B进入蛛网状的下腔和脑团体。与野生的型肺炎链双孢子球虫匹敌,脑室内演变的肺炎链双孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示事先指导在蛛网状的下腔对肺炎链双孢子球虫的心净不受挤入的返回首要由嗜中性粒细胞兼备,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤兴隆的的人,吞噬细胞尖锐的缩减。。

裁定:这种新的脑膜炎塑造容许实时辨析和形象肺炎双孢子球虫脑膜炎的主办宴会-起源相互作用。这是更多的看法PN犯病机制的一个人很前景的器。。

关键词:肺炎双孢子球虫脑膜炎  肺炎链双孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链双孢子球虫  斑马鱼  主办宴会-起源相互作用

放:Streptococcus pneumoniae是沉重地传染的首要解释。,如败血病、肺炎和脑膜炎。不过肺炎双孢子球虫疫苗和无效的抗菌装配已作出,但侵入性肺炎双孢子球虫病的弊病担子依然很高。,尤其资源变瘦的公务的。。肺炎双孢子球虫脑膜炎是孥和ADU的一种沉重地细菌的脑膜炎。。肺炎双孢子球虫性脑膜炎的易感性运动的和沉重地对准由HOS测量。大脑的心净屏蔽的不受挤入的规定和攻破。晚近,寄主的遗传兼备越来越受到民族的关怀。,比如,心净不受挤入的感受器(Toll样感受器4)、Fcγ(Fcγ)感受器和杀菌素零碎的遗传演变,决定其易感性运动的。,最要紧的是多聚糖威信。,有超越90种形形色色的树液型。。形形色色的树液型的笨蛋率和侵入性形形色色的。。另一个要紧毒力除数,它包孕细胞毒死溶血素和几种细胞外表上的胚乳。,比如,Streptococcus pneumoniae外表上的胚乳A(PSPA)。细菌和主办宴会私下的相干发动者肺炎的染色体组演变。遗传因子区的在与脱漏,与心染色体组正中鹄的单核糖酸演变都能补充病因惹起弊病和挤入弊病沉重地对准的资格。为了认为如何肺炎双孢子球虫的毒力,建造了形形色色的的实验窥探塑造。。这些窥探塑造的局限包孕伦理观成绩。、实验所需的高成本和高时期;这些限度局限使得窥探不方便大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)曾经发生一个人认为如何的人类病因或其互相牵连工具病因惹起的传染性弊病的要紧打字生物。斑马鱼是一种固有的和适用性不受挤入的零碎相似地人体不受挤入的零碎的多骨鱼。固有的不受挤入的零碎在斑马鱼胚胎开发区的前段阶段曾经兴隆的,受精后的适用性不受挤入的零碎为4。 – 6周参加战役。该塑造的另一个人优点是鉴于斑马鱼胚胎的细薄度和外延的的荧光性器,它可以实时认为如何主办宴会与病因私下的相互作用。。另一个的优点包孕斑马鱼的高繁殖力、胚胎外部的开发区与遗传因子主编器和G的希求。另外,该塑造使得于中容量过滤。,经过毒力不同或媒体过滤评议细菌演变所引起的。。亲密的,该塑造已被应用于形象和认为如何结核分支杆菌脑膜炎–一种中枢神经零碎传染病。另外,曾经证实斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎双孢子球虫传染并发生脑膜炎。认为如何决意是建造一种容许肺炎双孢子球虫病因相互作用的实时辨析的斑马鱼胚胎传染肺炎双孢子球虫脑膜炎塑造。传染的形象是遗传因子转移鱼(KDRL)的应用。:MCherry)白色荧光性网。,荧光性远红外颜料兼备荧光性印记抗。双印记MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更有充分细节却无法证实的地停止了认为如何斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光性中性粒细胞和白色荧光性巨噬细胞。

办法:细菌菌株与种植先决条件:肺炎链双孢子球虫2型野生的菌株D39和溶血素脱漏M 肺炎双孢子球虫菌株种植在含5%脱主要部份羊血的哥伦比亚特区石花菜断然地,培育先决条件37℃,5%的CO2。肺炎双孢子球虫菌株预示物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于外部的和体内成像。。氯胺苯醇g/kg媒体转变菌的过滤。细菌睡眠状态培育后,托德溶胶中添加酵母引得出的的认为如何 休伊特液,在37摄氏温度到对数使聚集在一点种植。。细菌搜集,以离心机分离(6000转/分),10分钟),无菌处理法汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,悬架于含20%醋精的PBS以达到预期的目的所需浓度和储在?80°C。开枪前,细菌悬架于无菌处理法(W/V)酚红答案中。,开枪审核形象。

斑马鱼后方、胚胎搂抱与开枪操控:(kdrl:mCherry野生的型斑马鱼网内皮细胞表达白色荧光性;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度种植,通氧,10/14h的光暗圈外界。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚甲基的蓝E3媒体正中鹄的PTU培育,令人忧愁地黑素细胞排队。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独自开枪1 NL肺炎链双孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的遗风实验:传染病毒后,突跃的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板正中鹄的培育,每组一孔,每孔20个胚胎。开枪后12小时和120小时测量死亡率。,在规则时期点监听活胚胎和死胚胎。,每个人实验均在3个一致实验中停止。。

斑马鱼胚胎的荧光性成像:HLPA荧光性显微镜 GFP肺炎链双孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎停止镜头学过滤。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光性细菌的胚胎在从前决定的时期点被准备。4%5-三┭烷规则睡眠状态。。随后,胚胎在100%℃原醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的时期工艺流程荧光性成像:一分钟内图像延续搜集。胚胎嵌在低熔点石花菜糖中答案于人工。,抚养在28度。。

不受挤入的团体化学颜料:anti-l-plastin颜料斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗透,10%规则山羊树液(NGS)正中鹄的1%种 PBTX关闭3h,合身异性对称体兼备的缩减。anti-l-plastin(1:500 v/v变细)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛树液白胚乳(BSA)室温下孵育睡眠状态。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育睡眠状态。。

团体病理辨析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%5-三┭烷规则,固体石腊包埋做切片,4微米厚。Nissl颜料,并注意颜料做切片。。

胜利:后脑脑室和尾动脉开枪肺炎链双孢子球虫惹起斑马鱼胚胎爆发性、服药量依赖性传染:脑室后传染:根究肺炎链双孢子球虫可惹起斑马鱼胚胎的脑膜炎,本人立即将细菌开枪到腹侧脑室。,传染是服药量依赖性的。,高服药量的细菌惹起早发,死亡率高。100CFU开枪液的存活比为88%。,300 CFU开枪存活比为25%。,600 CFU开枪存活比为5%。。

周遍性传染:肺炎双孢子球虫开枪液在高服药量下的服药量依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎使平衡遗风率为0。。与侧脑室开枪匹敌,尾动脉开枪可招致弊病开展较快。。在整体斑马鱼体内和中枢神经零碎都注意到细菌渗透物。团体学辨析表白,远在12的细菌 脑香精内呈现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎双孢子球虫性脑膜炎事先指导的固有的不受挤入的返回首要由中性粒细胞兼备。

裁定:曾经排队出了一种新的形象斑马鱼胚胎传染塑造。该塑造有助于本人对细菌的毒力除数和主办宴会恢复机制在肺炎双孢子球虫脑膜炎犯病机制中相互作用的变得流行。另外,本人注意到筹码Streptococcus pneumon的目标立即细菌毒性。,肺炎双孢子球虫脑膜炎的警戒、主办宴会介导的毒死介导的脑内。

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