斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是造成细菌传染的要紧事业经过。,细菌和主办宴会有毒的传染。在这项认为如何中,朕打开了斑马鱼胚胎肺炎二联等孢子球虫脑膜炎图案,为了实时勘测主办宴会前段的缩微片相互作用。。

办法:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室投入绿色荧光灯未经耕作的型肺炎链二联等孢子球虫D39或肺炎链二联等孢子球虫经过破裂的。kdrl:mCherry的情报转移斑马鱼线丛膜层想像, 抗L – PLASTIN染上或粘上后可勘测到吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。荧光灯共焦显微镜和推延显微镜成像。。

成功实现的事:尾动脉传染后,朕可以见肺炎二联等孢子球虫稠密在病灶的丛膜层。,细菌经过血脑B进入蛛网膜的下腔和脑团体。与未经耕作的型肺炎链二联等孢子球虫相干上地,脑室内变动的肺炎链二联等孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示一号在蛛网膜的下腔对肺炎链二联等孢子球虫的演绎地有免疫力的答复首要由嗜中性粒细胞使结合,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤敏捷,吞噬细胞内行缩减。。

意见:这种新的脑膜炎图案容许实时辨析和想像肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的主办宴会-缩微片相互作用。这是进一步地看法PN犯病机制的任一很勘察的器。。

关键词:肺炎二联等孢子球虫脑膜炎  肺炎链二联等孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链二联等孢子球虫  斑马鱼  主办宴会-缩微片相互作用

配乐:Streptococcus pneumoniae是悲哀传染的首要事业。,如脓毒疾、肺炎和脑膜炎。侮辱肺炎二联等孢子球虫疫苗和无效的抗菌医疗设备已作出,但打击性肺炎二联等孢子球虫病的恶心担负依然很高。,最最资源短路的国民。。肺炎二联等孢子球虫脑膜炎是子女和ADU的一种悲哀细菌的脑膜炎。。肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎的易感觉和悲哀评估由HOS决定。大脑的天然屏蔽的有免疫力的制约和违背。又几年中,寄主的遗传使结合越来越受到民间的的关怀。,拿 … 来说,演绎地有免疫力的感觉器官(Toll样感觉器官4)、Fcγ(Fcγ)感觉器官和矫正素零碎的遗传变动,决定其易感觉。,最要紧的是多聚糖荚。,有超越90种不寻常的血浆型。。不寻常的血浆型的笨蛋率和打击性不寻常的。。其余的要紧毒力因素,它包含细胞有毒的溶血素和几种细胞范围釉桨。,拿 … 来说,Streptococcus pneumoniae范围釉桨A(PSPA)。细菌和主办宴会经过的相干驱车旅行肺炎的染色体组变动。情报区的在与不足额,和激励染色体组击中要害单核糖酸变动都能增添病因造成恶心和心情恶心悲哀评估的生产能力。为了认为如何肺炎二联等孢子球虫的毒力,建造了不寻常的的实验捕鼠图案。。这些捕鼠图案的极限包含行为准则成绩。、实验所需的高成本和高工夫;这些限度局限使得捕鼠不同意大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)从前发生任一认为如何的人类病因或其互插植物病因造成的传染性恶心的要紧典型生物。斑马鱼是一种演绎地和柔软性有免疫力的零碎相似地人体有免疫力的零碎的多骨鱼。演绎地有免疫力的零碎在斑马鱼胚胎肿瘤的前段阶段从前敏捷的,受精后的柔软性有免疫力的零碎为4。 – 6周易弯曲的。该图案的另任一优点是鉴于斑马鱼胚胎的透迷和广泛应用的荧光灯器,它可以实时认为如何主办宴会与病因经过的相互作用。。其余的的优点包含斑马鱼的高繁殖力、胚胎外部的肿瘤与情报编辑程序器和G的愿望。不过,该图案引起于中容量掩藏。,经过毒力杂耍或介质掩藏评议细菌经过破裂的。。又,该图案已被应用于想像和认为如何结核分枝细菌脑膜炎–一种中枢神经零碎传染病。不过,从前证实斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎二联等孢子球虫传染并发生脑膜炎。认为如何意图是建造一种容许肺炎二联等孢子球虫病因相互作用的实时辨析的斑马鱼胚胎传染肺炎二联等孢子球虫脑膜炎图案。传染的想像是情报转移鱼(KDRL)的应用。:MCherry)白色荧光灯丛膜层。,荧光灯远红外染上或粘上使结合荧光灯捣碎抗。双捣碎MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更详尽的地举行了认为如何斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。

办法:细菌菌株与种植健康状况:肺炎链二联等孢子球虫2型未经耕作的菌株D39和溶血素不足额M 肺炎二联等孢子球虫菌株种植在含5%脱血纤维蛋白羊血的哥伦比亚特区洋菜枯燥无味的,培育健康状况37℃,5%的CO2。肺炎二联等孢子球虫菌株指派物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于外部的和体内成像。。氯胺苯醇g/kg介质转变菌的掩藏。细菌宿夜培育后,托德悬架中添加酵母萃取的的认为如何 休伊特液,在37摄氏温度到对数中心的种植。。细菌搜集,使离心(6000转/分),10分钟),不毛汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,漂流于含20%丙三醇的PBS以开腰槽所需浓度和储在?80°C。投入前,细菌漂流于不毛(W/V)酚红Aquarius水瓶座中。,投入进行想像。

斑马鱼背面、胚胎被领养的与投入巧妙地控制:(kdrl:mCherry未经耕作的型斑马鱼丛膜层内皮细胞表达白色荧光灯;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度种植,通氧,10/14h的光暗回路事实。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚木精蓝E3介质击中要害PTU培育,控制键黑素细胞编队。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独立投入1 NL肺炎链二联等孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的遗物实验:传染病毒后,破裂的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板击中要害培育,每组一孔,每孔20个胚胎。投入后12小时和120小时决定死亡率。,在固定的工夫点调查所活胚胎和死胚胎。,缠住实验均在3个一致实验中举行。。

斑马鱼胚胎的荧光灯成像:HLPA荧光灯显微镜 GFP肺炎链二联等孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎举行镜头学掩藏。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光灯细菌的胚胎在从前决定的工夫点被固定。4%3固定的宿夜。。随后,胚胎在100%℃原醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的工夫发生荧光灯成像:一分钟内图像陆续搜集。胚胎嵌在低熔点洋菜糖中解散于人工。,同意在28度。。

有免疫力的团体化学染上或粘上:anti-l-plastin染上或粘上斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗透,10%常态山羊血浆(NGS)击中要害1%种 PBTX关闭3h,适合异性对称体使结合的缩减。anti-l-plastin(1:500 v/v减少)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛血浆白釉桨(BSA)室温下孵育宿夜。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育宿夜。。

团体异常状态辨析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%3固定的,白腊包埋节,4微米厚。Nissl染上或粘上,并勘测染上或粘上节。。

成功实现的事:后脑脑室和尾动脉投入肺炎链二联等孢子球虫造成斑马鱼胚胎突然发生性、配料依赖性传染:脑室后传染:根究肺炎链二联等孢子球虫可造成斑马鱼胚胎的脑膜炎,朕直截了当地将细菌投入到腹侧脑室。,传染是配料依赖性的。,高配料的细菌造成早发,死亡率高。100CFU投入液的存活比为88%。,300 CFU投入存活比为25%。,600 CFU投入存活比为5%。。

一身性传染:肺炎二联等孢子球虫投入液在高配料下的配料依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎残忍的遗物率为0。。与侧脑室投入相干上地,尾动脉投入可事业恶心开展较快。。在总计达斑马鱼体内和中枢神经零碎都勘测到细菌浸湿性。团体学辨析传达,远在12的细菌 脑本色内涌现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎一号的演绎地有免疫力的答复首要由中性粒细胞使结合。

意见:从前打开出了一种新的想像斑马鱼胚胎传染图案。该图案有助于朕对细菌的毒力因素和主办宴会矫正机制在肺炎二联等孢子球虫脑膜炎犯病机制中相互作用的领会。不过,朕勘测到计划Streptococcus pneumon的瞄准直截了当地细菌毒性。,肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的防守、主办宴会介导的有毒的介导的脑内。

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