斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是触发某事细菌传染的要紧争辩经过。,细菌和节目主持人极有害的思想传染。在这项决定中,敝发达了斑马鱼胚胎肺炎二联等孢子球虫脑膜炎制作模型,为了实时观察所得节目主持人前段的缩微片相互作用。。

方式:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室坏透了的绿色荧光灯疯狂地型肺炎链二联等孢子球虫D39或肺炎链二联等孢子球虫间断的。kdrl:mCherry的情报转移斑马鱼线容器形象化, 抗L – PLASTIN染后可观察所得到吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。荧光灯共焦显微镜和推延显微镜成像。。

算是:尾动脉传染后,敝可以钞票肺炎二联等孢子球虫贪吃在焦点的容器。,细菌经过血脑B进入蛛网状的下腔和脑棉纸。与疯狂地型肺炎链二联等孢子球虫比拟,脑室内离解的肺炎链二联等孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示最好的在蛛网状的下腔对肺炎链二联等孢子球虫的后天免疫力弹回首要由嗜中性粒细胞娶,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤积极的的,吞噬细胞自明添加。。

决定:这种新的脑膜炎制作模型容许实时辨析和形象化肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的节目主持人-缩微片相互作用。这是更加看法PN损害机制的第一很有希望的器。。

关键词:肺炎二联等孢子球虫脑膜炎  肺炎链二联等孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链二联等孢子球虫  斑马鱼  节目主持人-缩微片相互作用

背景资料:Streptococcus pneumoniae是沉重地传染的首要争辩。,如败血病、肺炎和脑膜炎。话虽这样说肺炎二联等孢子球虫疫苗和无效的抗菌消除已作出,但袭取性肺炎二联等孢子球虫病的传染担负依然很高。,格外资源短期的的国度。。肺炎二联等孢子球虫脑膜炎是孥和ADU的一种沉重地细菌的脑膜炎。。肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎的易归纳法的和沉重地依等级排列由HOS判定。大脑的敢情屏蔽的免疫力国家的和使失败。日前几年中,寄主的遗传娶越来越受到人类的关怀。,比如,后天免疫力接受器(Toll样接受器4)、Fcγ(Fcγ)接受器和杀菌素体系的遗传离解,决定其易归纳法的。,最要紧的是多醣注意。,有超越90种确切的浆液型。。确切的浆液型的运送率和袭取性确切的。。另外要紧毒力行列式,它包含细胞极有害的思想溶血素和几种细胞表层釉桨。,比如,Streptococcus pneumoniae表层釉桨A(PSPA)。细菌和节目主持人暗做成某事相干驱动器肺炎的染色体组离解。情报区的在与缺陷,也紧排染色体组做成某事单核糖酸离解都能添加病因触发某事传染和撞击传染沉重地依等级排列的能耐。为了决定肺炎二联等孢子球虫的毒力,找到了确切的的实验捕鼠制作模型。。这些捕鼠制作模型的起限度局限作用的规则包含伦理观成绩。、实验所需的高成本和高工夫;这些限度局限使得捕鼠不胜任的大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)曾经译成第一决定的人类病因或其相干人病因触发某事的传染性传染的要紧榜样生物。斑马鱼是一种后天和柔度免疫力体系类似地人体免疫力体系的海鲢。后天免疫力体系在斑马鱼胚胎一茬植株的前段阶段曾经积极的,受精后的柔度免疫力体系为4。 – 6周敏捷。该制作模型的另第一优点是鉴于斑马鱼胚胎的播送和在海外的荧光灯器,它可以实时决定节目主持人与病因暗做成某事相互作用。。另外的优点包含斑马鱼的高繁殖力、胚胎表面上的一茬植株与情报编译程序器和G的愿望。以及,该制作模型构成疑问句和否定句于中容量滤色镜。,经过毒力变更或底物滤色镜评议细菌间断的。。日前,该制作模型已被应用于形象化和决定结核分支杆菌脑膜炎–一种中枢神经体系传染病。以及,曾经检定斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎二联等孢子球虫传染并发生脑膜炎。决定客观的是找到一种容许肺炎二联等孢子球虫病因相互作用的实时辨析的斑马鱼胚胎传染肺炎二联等孢子球虫脑膜炎制作模型。传染的形象化是情报转移鱼(KDRL)的运用。:MCherry)白色荧光灯容器。,荧光灯远红外染娶荧光灯手势抗。双手势MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更详述的地停止了决定斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。

方式:细菌菌株与开发必要条件:肺炎链二联等孢子球虫2型疯狂地菌株D39和溶血素缺陷M 肺炎二联等孢子球虫菌株开发在含5%脱细绳羊血的哥伦比亚特区冻粉厚板,培育必要条件37℃,5%的CO2。肺炎二联等孢子球虫菌株注意物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于表面上的和体内成像。。左菌素g/kg底物转变菌的滤色镜。细菌提供住宿培育后,托德悬架中添加酵母引得出的的决定 休伊特液,在37摄氏温度到对数居中开发。。细菌搜集,使离心(6000转/分),10分钟),不孕汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,悬架于含20%丙三醇的PBS以达到所需浓度和储在?80°C。坏透了的前,细菌悬架于不孕(W/V)酚红酒中。,坏透了的航线形象化。

斑马鱼属、胚胎保护树与坏透了的用双手触摸、举起或握住:(kdrl:mCherry疯狂地型斑马鱼容器内皮细胞表达白色荧光灯;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度开发,通氧,10/14h的光暗圆形的事实。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚木精蓝E3底物做成某事PTU培育,限制黑素细胞整队。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独自坏透了的1 NL肺炎链二联等孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的遗物实验:传染病毒后,间断的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板做成某事培育,每组一孔,每孔20个胚胎。坏透了的后12小时和120小时判定死亡率。,在使坚固或稳固工夫点测量土地活胚胎和死胚胎。,全部实验均在3个一致实验中停止。。

斑马鱼胚胎的荧光灯成像:HLPA荧光灯显微镜 GFP肺炎链二联等孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎停止镜头学滤色镜。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光灯细菌的胚胎在事先决定的工夫点被解释。4%1使坚固或稳固提供住宿。。随后,胚胎在100%℃木醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的工夫越过荧光灯成像:一分钟内图像延续搜集。胚胎嵌在低熔点冻粉糖中使液化于人工。,拿在28度。。

免疫力棉纸化学染:anti-l-plastin染斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗透,10%标准的山羊浆液(NGS)做成某事1%种 PBTX关闭3h,恰当的异性对称体娶的添加。anti-l-plastin(1:500 v/v变薄)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛浆液白釉桨(BSA)室温下孵育提供住宿。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育提供住宿。。

棉纸异常状态辨析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%1使坚固或稳固,地蜡包埋把正式送入精神病院,4微米厚。Nissl染,并观察所得染把正式送入精神病院。。

算是:后脑脑室和尾动脉坏透了的肺炎链二联等孢子球虫触发某事斑马鱼胚胎大发其财性、一回依赖性传染:脑室后传染:讨论肺炎链二联等孢子球虫可触发某事斑马鱼胚胎的脑膜炎,敝连续的将细菌坏透了的到腹侧脑室。,传染是一回依赖性的。,高一回的细菌触发某事早发,死亡率高。100CFU坏透了的液的存活比为88%。,300 CFU坏透了的存活比为25%。,600 CFU坏透了的存活比为5%。。

从头到脚性传染:肺炎二联等孢子球虫坏透了的液在高一回下的一回依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎平衡遗物率为0。。与侧脑室坏透了的比拟,尾动脉坏透了的可造成传染开展较快。。在完全的斑马鱼体内和中枢神经体系都观察所得到细菌渗透或浸透。棉纸学辨析解释,远在12的细菌 脑精髓内涌现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎最好的的后天免疫力弹回首要由中性粒细胞娶。

决定:曾经发达出了一种新的形象化斑马鱼胚胎传染制作模型。该制作模型有助于敝对细菌的毒力行列式和节目主持人国防部机制在肺炎二联等孢子球虫脑膜炎损害机制中相互作用的默认。以及,敝观察所得到计数器Streptococcus pneumon的目标连续的细菌毒性。,肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的进行辩护、节目主持人介导的极有害的思想介导的脑内。

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