斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是理由细菌传染的要紧存款经过。,细菌和做东道主极有害的思想传染。在这项课题中,我们家开拓了斑马鱼胚胎肺炎双孢子球虫脑膜炎从前的,为了实时值班人员做东道主晚期的起源相互作用。。

办法:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室射手绿色荧光灯野生的型肺炎链双孢子球虫D39或肺炎链双孢子球虫解体的。kdrl:mCherry的情报转移斑马鱼线管束形象化, 抗L – PLASTIN染色工艺后可值班人员到吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。荧光灯共焦显微镜和推延显微镜成像。。

后果:尾动脉传染后,我们家可以布告肺炎双孢子球虫阻塞在病灶的管束。,细菌经过血脑B进入蛛网状的下腔和脑布局。与野生的型肺炎链双孢子球虫比得上,脑室内解体的肺炎链双孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示最前部在蛛网状的下腔对肺炎链双孢子球虫的内在的豁免应唱圣歌首要由嗜中性粒细胞团结,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤无效的,吞噬细胞变明朗缩减。。

定论:这种新的脑膜炎从前的容许实时剖析和形象化肺炎双孢子球虫脑膜炎的做东道主-起源相互作用。这是进一步地认得PN爆发性的机制的一很前景的器。。

关键词:肺炎双孢子球虫脑膜炎  肺炎链双孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链双孢子球虫  斑马鱼  做东道主-起源相互作用

背景幕布:Streptococcus pneumoniae是墓穴传染的首要存款。,如血中毒、肺炎和脑膜炎。侮辱肺炎双孢子球虫疫苗和无效的抗菌搀杂已作出,但猛打性肺炎双孢子球虫病的某种具体疾病担子依然很高。,特别资源突然的地区。。肺炎双孢子球虫脑膜炎是孥和ADU的一种墓穴细菌的脑膜炎。。肺炎双孢子球虫性脑膜炎的易诱导的和墓穴年级由HOS做出决定。大脑的不做作地屏蔽的豁免州和杀死。最近的几年中,寄主的遗传团结越来越受到人道的关怀。,比如,内在的豁免接收器(Toll样接收器4)、Fcγ(Fcγ)接收器和矫正素零碎的遗传解体,决定其易诱导的。,最要紧的是多醣预示。,有超越90种意见分歧血浆型。。意见分歧血浆型的对读者率和猛打性意见分歧。。及其他要紧毒力以代理商的身份行事,它包孕细胞极有害的思想溶血素和几种细胞外表上的卵白。,比如,Streptococcus pneumoniae外表上的卵白A(PSPA)。细菌和做东道主当打中相干原动力肺炎的染色体组解体。情报区的在与缺点,因此心染色体组打中单核糖酸解体都能补充物病菌理由某种具体疾病和冲击力某种具体疾病墓穴年级的容量。为了课题肺炎双孢子球虫的毒力,构筑了意见分歧的实验捕鼠从前的。。这些捕鼠从前的的局限包孕伦理观成绩。、实验所需的高成本和高时期;这些限度局限使得捕鼠不完全大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)早已变成一课题的人类病菌或其互相牵连工具病菌理由的传染性某种具体疾病的要紧铅字生物。斑马鱼是一种内在的和可调性豁免零碎相似地人体豁免零碎的多骨鱼。内在的豁免零碎在斑马鱼胚胎开发的晚期阶段早已有效的,受精后的可调性豁免零碎为4。 – 6周发挥。该从前的的另一优点是鉴于斑马鱼胚胎的播送和广阔的的荧光灯器,它可以实时课题做东道主与病菌当打中相互作用。。及其他的优点包孕斑马鱼的高繁殖力、胚胎表面上的开发与情报编译程序器和G的有用性。同时,该从前的停止于中容量庇护。,经过毒力代替物或基层庇护评议细菌解体的。。最近的,该从前的已被应用于形象化和课题结核分枝细菌脑膜炎–一种中枢神经零碎传染病。同时,早已颁发专业合格证书斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎双孢子球虫传染并发生脑膜炎。课题终点是构筑一种容许肺炎双孢子球虫病菌相互作用的实时剖析的斑马鱼胚胎传染肺炎双孢子球虫脑膜炎从前的。传染的形象化是情报转移鱼(KDRL)的运用。:MCherry)白色荧光灯管束。,荧光灯远红外染色工艺团结荧光灯打手势抗。双打手势MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更清楚的地停止了课题斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。

办法:细菌菌株与开展必要条件:肺炎链双孢子球虫2型野生的菌株D39和溶血素缺点M 肺炎双孢子球虫菌株开展在含5%脱硬纸板纤维板羊血的哥伦比亚特区洋菜单调的,培育必要条件37℃,5%的CO2。肺炎双孢子球虫菌株预示物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于表面上的和体内成像。。氯胺苯醇g/kg基层转变菌的庇护。细菌以睡觉打发日子培育后,托德悬架中添加酵母引得出的的课题 休伊特液,在37摄氏温度到对数正中开展。。细菌搜集,离心分离机(6000转/分),10分钟),无病毒汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,暂停于含20%丙三醇的PBS以得到所需浓度和储在?80°C。射手前,细菌暂停于无病毒(W/V)酚红烫伤中。,射手褶皱形象化。

斑马鱼饲用的、胚胎保育员与射手动手术:(kdrl:mCherry野生的型斑马鱼管束内皮细胞表达白色荧光灯;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度开展,通氧,10/14h的光暗宫内避孕环外界。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚异丙基苯蓝E3基层打中PTU培育,令人忧愁地黑素细胞使符合。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独立射手1 NL肺炎链双孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的生存实验:传染病毒后,打破的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板打中培育,每组一孔,每孔20个胚胎。射手后12小时和120小时做出决定死亡率。,在常客时期点监控活胚胎和死胚胎。,个人财产实验均在3个一致实验中停止。。

斑马鱼胚胎的荧光灯成像:HLPA荧光灯显微镜 GFP肺炎链双孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎停止镜头学庇护。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光灯细菌的胚胎在以前决定的时期点被固着。4%仲甲醛常客以睡觉打发日子。。随后,胚胎在100%℃原醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的时期发达荧光灯成像:一分钟内图像陆续搜集。胚胎嵌在低熔点洋菜糖中崩溃于人工。,包含在28度。。

豁免布局化学染色工艺:anti-l-plastin染色工艺斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗滤,10%主力队员山羊血浆(NGS)打中1%种 PBTX亲近的3h,健壮的异性对称体团结的缩减。anti-l-plastin(1:500 v/v变薄)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛血浆白卵白(BSA)室温下孵育以睡觉打发日子。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育以睡觉打发日子。。

布局异常状态剖析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%仲甲醛常客,白腊包埋节,4微米厚。Nissl染色工艺,并值班人员染色工艺节。。

后果:后脑脑室和尾动脉射手肺炎链双孢子球虫理由斑马鱼胚胎向外砸开性、配药依赖性传染:脑室后传染:讨论肺炎链双孢子球虫可理由斑马鱼胚胎的脑膜炎,我们家指示方向将细菌射手到腹侧脑室。,传染是配药依赖性的。,高配药的细菌理由早发,死亡率高。100CFU射手液的存活比为88%。,300 CFU射手存活比为25%。,600 CFU射手存活比为5%。。

全体性传染:肺炎双孢子球虫射手液在高配药下的配药依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎平常的生存率为0。。与侧脑室射手比得上,尾动脉射手可实现某种具体疾病开展较快。。在全部的斑马鱼体内和中枢神经零碎都值班人员到细菌醉汉。布局学剖析标明,远在12的细菌 脑材料内呈现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎双孢子球虫性脑膜炎最前部的内在的豁免应唱圣歌首要由中性粒细胞团结。

定论:早已开拓出了一种新的形象化斑马鱼胚胎传染从前的。该从前的有助于我们家对细菌的毒力以代理商的身份行事和做东道主矫正机制在肺炎双孢子球虫脑膜炎爆发性的机制中相互作用的投合心意。同时,我们家值班人员到相反的Streptococcus pneumon的目标指示方向细菌毒性。,肺炎双孢子球虫脑膜炎的戒、做东道主介导的极有害的思想介导的脑内。

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