斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是使遭受细菌传染的要紧存款经过。,细菌和主人毒质传染。在这项认为如何中,本人利用了斑马鱼胚胎肺炎二联等孢子球虫脑膜炎霉,为了实时观看主人特大的大写字母的缩微片相互作用。。

办法:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室颜色会多样的绿色荧光灯使逃避困难的型肺炎链二联等孢子球虫D39或肺炎链二联等孢子球虫异常的。kdrl:mCherry的遗传物质转移斑马鱼线飞船想像, 抗L – PLASTIN颜料后可观留心吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。荧光灯共焦显微镜和推延显微镜成像。。

比分:尾动脉传染后,本人可以留心肺炎二联等孢子球虫拥挤在病灶的飞船。,细菌经过血脑B进入蛛网状的下腔和脑机构。与使逃避困难的型肺炎链二联等孢子球虫匹敌,脑室内异常的肺炎链二联等孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示特大的大写字母在蛛网状的下腔对肺炎链二联等孢子球虫的心净有免疫力的应唱圣歌次要由嗜中性粒细胞兼备,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤爽快而清新的的,吞噬细胞变明朗缩减。。

决定:这种新的脑膜炎霉容许实时辨析和想像肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的主人-缩微片相互作用。这是附加的看法PN不健全机制的一体很期望的器。。

关键词:肺炎二联等孢子球虫脑膜炎  肺炎链二联等孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链二联等孢子球虫  斑马鱼  主人-缩微片相互作用

交流声:Streptococcus pneumoniae是认真的传染的次要存款。,如脓毒病、肺炎和脑膜炎。还是肺炎二联等孢子球虫疫苗和无效的抗菌行医已作出,但袭取性肺炎二联等孢子球虫病的某种具体疾病担子依然很高。,格外资源使瘦的政府。。肺炎二联等孢子球虫脑膜炎是幼雏和ADU的一种认真的细菌的脑膜炎。。肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎的易归纳法的和认真的度数由HOS测量。大脑的心净屏蔽的有免疫力的规定和残害。近似几年中,寄主的遗传兼备越来越受到布满的关怀。,譬如,心净有免疫力的接收器(Toll样接收器4)、Fcγ(Fcγ)接收器和杀菌素零碎的遗传异常,决定其易归纳法的。,最要紧的是直链淀粉以瓶盖密封。,有超越90种形形色色的树液型。。形形色色的树液型的随带率和袭取性形形色色的。。其余的要紧毒力代理人,它包罗细胞毒质溶血素和几种细胞在表面工作蛋清。,譬如,Streptococcus pneumoniae在表面工作蛋清A(PSPA)。细菌和主人私下的相干车道肺炎的染色体组异常。遗传物质区的在与不足,除此之外地核染色体组说话中肯单核糖酸异常都能加强病菌使遭受某种具体疾病和使发生某种具体疾病认真的度数的充其量的。为了认为如何肺炎二联等孢子球虫的毒力,使变得了形形色色的的实验老鼠霉。。这些老鼠霉的边界包罗道德学成绩。、实验所需的高成本和高工夫;这些限度局限使得老鼠不适宜的大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)先于变得一体认为如何的人类病菌或其互插创造物病菌使遭受的传染性某种具体疾病的要紧测定生物。斑马鱼是一种直觉的和可塑性有免疫力的零碎类似地人体有免疫力的零碎的海鲢。直觉的有免疫力的零碎在斑马鱼胚胎被开展的状态的特大的大写字母阶段先于爽快而清新的,受精后的可塑性有免疫力的零碎为4。 – 6周实行。该霉的另一体优点是鉴于斑马鱼胚胎的传动装置和范围广泛的的荧光灯器,它可以实时认为如何主人与病菌私下的相互作用。。其余的的优点包罗斑马鱼的高繁殖力、胚胎外部的被开展的状态与遗传物质编者器和G的希求。除此之外,该霉代替动词于中容量准备工作。,经过毒力多样或浊塞音准备工作评议细菌异常的。。近似,该霉已被应用于想像和认为如何结核分支杆菌脑膜炎–一种中枢神经零碎传染病。除此之外,先于公开宣称斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎二联等孢子球虫传染并发生脑膜炎。认为如何目标是使变得一种容许肺炎二联等孢子球虫病菌相互作用的实时辨析的斑马鱼胚胎传染肺炎二联等孢子球虫脑膜炎霉。传染的想像是遗传物质转移鱼(KDRL)的运用。:MCherry)白色荧光灯飞船。,荧光灯远红外颜料兼备荧光灯指出抗。双指出MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更细目地举行了认为如何斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光灯中性粒细胞和白色荧光灯巨噬细胞。

办法:细菌菌株与扩展限制:肺炎链二联等孢子球虫2型使逃避困难的菌株D39和溶血素不足M 肺炎二联等孢子球虫菌株扩展在含5%脱细丝的羊血的哥伦比亚特区石花菜平直地,培育限制37℃,5%的CO2。肺炎二联等孢子球虫菌株指出物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于外部的和体内成像。。氯胺苯醇g/kg浊塞音转变菌的准备工作。细菌借宿培育后,托德悬架中添加酵母熬汁的认为如何 休伊特液,在37摄氏温度到对数正中扩展。。细菌搜集,离心分离机(6000转/分),10分钟),内容贫乏汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,延缓于含20%醋精的PBS以开腰槽所需浓度和储在?80°C。颜色会多样的前,细菌延缓于内容贫乏(W/V)酚红酒中。,颜色会多样的工艺流程想像。

斑马鱼类型、胚胎怀抱与颜色会多样的运算:(kdrl:mCherry使逃避困难的型斑马鱼飞船内皮细胞表达白色荧光灯;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度扩展,通氧,10/14h的光暗圈子事件。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚木精蓝E3浊塞音说话中肯PTU培育,衰落黑素细胞表格。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独立颜色会多样的1 NL肺炎链二联等孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的遗风实验:传染病毒后,破晓的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板说话中肯培育,每组一孔,每孔20个胚胎。颜色会多样的后12小时和120小时测量死亡率。,在集中:稳定地集中或指向:工夫点鉴定书活胚胎和死胚胎。,自己的事物实验均在3个一致实验中举行。。

斑马鱼胚胎的荧光灯成像:HLPA荧光灯显微镜 GFP肺炎链二联等孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎举行镜头学准备工作。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光灯细菌的胚胎在先于决定的工夫点被应急措施。4%三聚甲醛集中:稳定地集中或指向:借宿。。随后,胚胎在100%℃伯醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的工夫工艺流程荧光灯成像:一分钟内图像延续搜集。胚胎嵌在低熔点石花菜糖中液化于人工。,保留在28度。。

有免疫力的机构化学颜料:anti-l-plastin颜料斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗透,10%正规军山羊树液(NGS)说话中肯1%种 PBTX关闭3h,安装异性对称体兼备的缩减。anti-l-plastin(1:500 v/v冲淡的)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛树液白蛋清(BSA)室温下孵育借宿。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育借宿。。

机构病理辨析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%三聚甲醛集中:稳定地集中或指向:,固体石腊包埋片,4微米厚。Nissl颜料,并观看颜料片。。

比分:后脑脑室和尾动脉颜色会多样的肺炎链二联等孢子球虫使遭受斑马鱼胚胎迅速致富性、配料依赖性传染:脑室后传染:讨论肺炎链二联等孢子球虫可使遭受斑马鱼胚胎的脑膜炎,本人指示方向将细菌颜色会多样的到腹侧脑室。,传染是配料依赖性的。,高配料的细菌使遭受早发,死亡率高。100CFU颜色会多样的液的存活比为88%。,300 CFU颜色会多样的存活比为25%。,600 CFU颜色会多样的存活比为5%。。

浑身性传染:肺炎二联等孢子球虫颜色会多样的液在高配料下的配料依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎相等地遗风率为0。。与侧脑室颜色会多样的匹敌,尾动脉颜色会多样的可引起某种具体疾病开展较快。。在专门斑马鱼体内和中枢神经零碎都观留心细菌潜入。机构学辨析弄清,远在12的细菌 脑香精内涌现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎特大的大写字母的直觉的有免疫力的应唱圣歌次要由中性粒细胞兼备。

决定:先于利用出了一种新的想像斑马鱼胚胎传染霉。该霉有助于本人对细菌的毒力代理人和主人谋划抵御机制在肺炎二联等孢子球虫脑膜炎不健全机制中相互作用的忧虑。除此之外,本人观留心对立面Streptococcus pneumon的目的指示方向细菌毒性。,肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的阻止、主人介导的毒质介导的脑内。

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