斑马鱼胚胎:一种实时荧光肺炎球菌脑膜炎模型

摘要:Streptococcus pneumoniae是通向细菌传染的要紧思考经过。,细菌和酒店业主毒药传染。在这项以为中,民众切开了斑马鱼胚胎肺炎二联等孢子球虫脑膜炎在前的,为了实时评述酒店业主最前部的缩微快速地流动相互作用。。

方式:斑马鱼胚胎在尾动脉或后脑脑室入轨绿色荧光性未驯的型肺炎链二联等孢子球虫D39或肺炎链二联等孢子球虫异常的。kdrl:mCherry的遗传物质转移斑马鱼线丛膜层形象化, 抗L – PLASTIN染上或粘上后可评述到吞噬细胞。。MPX:GFP / MPEG1:mCherry斑马鱼,有绿色荧光性中性粒细胞和白色荧光性巨噬细胞。荧光性共焦显微镜和推延显微镜成像。。

算是:尾动脉传染后,民众可以牧座肺炎二联等孢子球虫拥挤在焦点的丛膜层。,细菌经过血脑B进入蛛网膜的下腔和脑安排。与未驯的型肺炎链二联等孢子球虫对照,脑室内异常的肺炎链二联等孢子球虫显示GRO。。共焦成像显示概要的在蛛网膜的下腔对肺炎链二联等孢子球虫的自是免除反应性次要由嗜中性粒细胞联合集团,溶血素介导的Streptococcus pneumoniae毙伤起作用的,吞噬细胞变清澈提升。。

断定:这种新的脑膜炎在前的容许实时辨析和形象化肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的酒店业主-缩微快速地流动相互作用。这是较远的看法PN前进机制的第一很有指望的器。。

关键词:肺炎二联等孢子球虫脑膜炎  肺炎链二联等孢子球虫溶血素  活细胞成像  肺炎链二联等孢子球虫  斑马鱼  酒店业主-缩微快速地流动相互作用

安排:Streptococcus pneumoniae是令人伤心或痛苦的传染的次要思考。,如脓毒病、肺炎和脑膜炎。尽管肺炎二联等孢子球虫疫苗和无效的抗菌有助于已作出,但打击性肺炎二联等孢子球虫病的呕吐担负依然很高。,最最资源变薄的州。。肺炎二联等孢子球虫脑膜炎是膝下和ADU的一种令人伤心或痛苦的细菌的脑膜炎。。肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎的易情感和令人伤心或痛苦的水平线由HOS终止。大脑的自是屏蔽的免除健康状况和毁坏。再度几年中,寄主的遗传联合集团越来越受到民众的关怀。,像,自是免除接收器(Toll样接收器4)、Fcγ(Fcγ)接收器和杀菌素零碎的遗传异常,决定其易情感。,最要紧的是直链淀粉威信。,有超越90种卓越的浆液型。。卓越的浆液型的引起率和打击性卓越的。。其他的要紧毒力免疫因子,它包含细胞毒药溶血素和几种细胞外面的卵白。,像,Streptococcus pneumoniae外面的卵白A(PSPA)。细菌和酒店业主私下的相干车道肺炎的染色体组异常。遗传物质区的在与缺点,而且去核染色体组说得中肯单核糖酸异常都能提升病因通向呕吐和挤入呕吐令人伤心或痛苦的水平线的生产率。为了以为肺炎二联等孢子球虫的毒力,构造了卓越的的实验捕鼠在前的。。这些捕鼠在前的的极限包含伦理观成绩。、实验所需的高成本和高时期;这些限度局限使得捕鼠不适宜的大规模筛查。。斑马鱼(Danio rerio)先行变得第一以为的人类病因或其家庭般的温暖定位小动物病因通向的传染性呕吐的要紧典型生物。斑马鱼是一种演绎的推理地和柔软性免除零碎相似地人体免除零碎的海鲢。演绎的推理地免除零碎在斑马鱼胚胎被开展的状态的最前部阶段先行活跃的,受精后的柔软性免除零碎为4。 – 6周训练。该在前的的另第一优点是鉴于斑马鱼胚胎的播送和普遍地的荧光性器,它可以实时以为酒店业主与病因私下的相互作用。。其他的的优点包含斑马鱼的高繁殖力、胚胎外面的被开展的状态与遗传物质编辑程序器和G的适用性。而且,该在前的使得于中容量准备。,经过毒力种类或血管中层准备评议细菌异常的。。再度,该在前的已被应用于形象化和以为结核分支杆菌脑膜炎–一种中枢神经零碎传染病。而且,先行声明斑马鱼胚胎和成丁斑马鱼易受肺炎二联等孢子球虫传染并发生脑膜炎。以为致力于是构造一种容许肺炎二联等孢子球虫病因相互作用的实时辨析的斑马鱼胚胎传染肺炎二联等孢子球虫脑膜炎在前的。传染的形象化是遗传物质转移鱼(KDRL)的运用。:MCherry)白色荧光性丛膜层。,荧光性远红外染上或粘上联合集团荧光性评分抗。双评分MPX:GFP / MPEG1:mCherry中更明确的地停止了以为斑马鱼吞噬细胞动力学,有绿色荧光性中性粒细胞和白色荧光性巨噬细胞。

方式:细菌菌株与涌现制约:肺炎链二联等孢子球虫2型未驯的菌株D39和溶血素缺点M 肺炎二联等孢子球虫菌株涌现在含5%脱用钉书钉钉住羊血的哥伦比亚特区石花菜平的,培育制约37℃,5%的CO2。肺炎二联等孢子球虫菌株评分物HLPA-GFP是致命的。,它已被用于外面的和体内成像。。左菌素g/kg血管中层转变菌的准备。细菌以睡觉打发日子培育后,托德暂停中添加酵母抽出物的以为 休伊特液,在37摄氏温度到对数家庭般的温暖涌现。。细菌搜集,离心分离机(6000转/分),10分钟),不毛汽水缓冲盐水(PBS)冲洗,暂停于含20%醋精的PBS以达到所需浓度和储在?80°C。入轨前,细菌暂停于不毛(W/V)酚红烈性酒中。,入轨快速地流动形象化。

斑马鱼种类、胚胎保护虫与入轨处理:(kdrl:mCherry未驯的型斑马鱼丛膜层内皮细胞表达白色荧光性;MPEG1:mCherry斑马鱼表达绿色中性粒细胞和白色吞噬细胞,在26度涌现,通氧,10/14h的光暗宫内避孕环典礼。。受精后1h搜集斑马鱼胚胎,在28度加0.3。 添加到Mg/L亚含甲基的蓝E3血管中层说得中肯PTU培育,限定黑素细胞表格。斑马鱼胚胎在后脑脑室或尾动脉独自入轨1 NL肺炎链二联等孢子球虫。

受传染斑马鱼胚胎的遗物实验:传染病毒后,突跃的斑马鱼胚胎,28孔C在6孔板说得中肯培育,每组一孔,每孔20个胚胎。入轨后12小时和120小时终止死亡率。,在扣紧时期点调查活胚胎和死胚胎。,全部的实验均在3个一致实验中停止。。

斑马鱼胚胎的荧光性成像:HLPA荧光性显微镜 GFP肺炎链二联等孢子球虫传染和非传染斑马鱼胚胎停止镜头学准备。未受传染的对照斑马鱼胚胎和传染后可见荧光性细菌的胚胎在先行决定的时期点被固定。4%5-三┭烷扣紧以睡觉打发日子。。随后,胚胎在100%℃伯醇中贮存20℃。。

斑马鱼胚胎的时期通过荧光性成像:一分钟内图像延续搜集。胚胎嵌在低熔点石花菜糖中分流于人工。,留在心中在28度。。

免除安排化学染上或粘上:anti-l-plastin染上或粘上斑马鱼胚胎吞噬细胞。冻融胚胎,PBTX洗濯后,Trypsin渗透,10%有规律的山羊浆液(NGS)说得中肯1%种 PBTX结束3h,合身异性对称体联合集团的提升。anti-l-plastin(1:500 v/v冲淡)对称体缓冲溶液(1%(v/v)和1%(W/V)牛浆液白卵白(BSA)室温下孵育以睡觉打发日子。1h洗濯后与PBTX孵育。。胚胎与山羊抗兔2孵育以睡觉打发日子。。

安排病理辨析:三卡因麻醉斑马鱼胚胎,4%5-三┭烷扣紧,固体石腊包埋部分,4微米厚。Nissl染上或粘上,并评述染上或粘上部分。。

算是:后脑脑室和尾动脉入轨肺炎链二联等孢子球虫通向斑马鱼胚胎爆发性、药量依赖性传染:脑室后传染:讨论肺炎链二联等孢子球虫可通向斑马鱼胚胎的脑膜炎,民众最接近的将细菌入轨到腹侧脑室。,传染是药量依赖性的。,高药量的细菌通向早发,死亡率高。100CFU入轨液的存活比为88%。,300 CFU入轨存活比为25%。,600 CFU入轨存活比为5%。。

浑身性传染:肺炎二联等孢子球虫入轨液在高药量下的药量依赖性传染。100CFU /胚胎,300 CFU 胚胎与600 CFU 胚胎吝啬的遗物率为0。。与侧脑室入轨对照,尾动脉入轨可招致呕吐开展较快。。在统统斑马鱼体内和中枢神经零碎都评述到细菌渗透。安排学辨析暗示,远在12的细菌 脑必要的内涌现HPI。。斑马鱼胚胎中肺炎二联等孢子球虫性脑膜炎概要的的演绎的推理地免除反应性次要由中性粒细胞联合集团。

断定:先行切开出了一种新的形象化斑马鱼胚胎传染在前的。该在前的有助于民众对细菌的毒力免疫因子和酒店业主重获机制在肺炎二联等孢子球虫脑膜炎前进机制中相互作用的了解。而且,民众评述到筹码Streptococcus pneumon的对象最接近的细菌毒性。,肺炎二联等孢子球虫脑膜炎的避免、酒店业主介导的毒药介导的脑内。

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